实验介绍
一、服务简介
实时荧光 PCR（real-time PCR）作为定量 PCR（Q-PCR）领域的核心技术，凭借实时动态监测 DNA 扩增量的特性，能够实现核酸分子的精准绝对定量或相对定量分析。其技术优势在于：
- 高特异性与灵敏度：通过荧光探针或染料实时追踪扩增过程，可有效区分特异性扩增产物与非特异性产物，即使是低丰度的核酸分子（如微量 mRNA、microRNA、lncRNA 及特定基因组 DNA 片段）也能被精准捕获，检测下限可达单拷贝级别。
- 广适性检测范围：可覆盖多种核酸类型，包括 mRNA 表达量分析、microRNA 调控研究、lncRNA 功能探索以及基因组 DNA 拷贝数变异（CNV）检测等，满足基础研究、临床诊断、药物研发等多场景需求。
- 高效定量能力：相比传统终点 PCR，无需进行凝胶电泳等后续处理，直接通过扩增曲线计算初始模板量，大幅缩短实验周期，同时减少人为操作误差，结果重复性更高。
二、服务流程
1. 引物设计与合成
- 专业设计：结合目的基因序列特征（如 GC 含量、二级结构）及物种特异性，采用主流引物设计软件（如 Primer Premier、Oligo）进行设计，确保引物特异性强、扩增效率高（90%-110%），避免引物二聚体及非特异性结合。
- 合成质控：委托资质齐全的供应商进行引物合成，交付前通过质谱检测确保纯度（PAGE 级或 HPLC 级），并提供合成报告及电泳验证结果，保障实验准确性。
2. DNA / RNA 抽提
- 样本预处理：针对不同样本类型（全血、组织、细胞）采用优化方案 —— 全血样本使用 EDTA 抗凝处理，组织样本经液氮研磨破碎，细胞样本通过胰酶消化收集，确保核酸释放充分。
- 抽提纯化：采用磁珠法或柱提法，配合专用核酸提取试剂盒，高效去除蛋白质、多糖、抑制剂等杂质，获得高纯度（OD260/280 介于 1.8-2.0）、高完整性的核酸，满足后续实验要求。
3. 反转录（仅 RNA 样本）
- 体系优化：根据 RNA 浓度调整反转录体系，选用高活性逆转录酶（如 M-MLV、SuperScript），在 37-42℃ 条件下将 RNA 逆转录为 cDNA，同时设置无逆转录酶对照（NRT），排除基因组 DNA 污染干扰。
4. 上机定量分析
- 反应体系配置：严格按照标准操作流程，将模板（DNA 或 cDNA）、引物、荧光染料（如 SYBR Green）或探针、PCR 混合液等按比例混合，设置 3 次以上生物学重复及阴性对照（NTC），保证结果可靠性。
- 仪器检测：使用 Roche LightCycler、ABI StepOnePlus 等主流实时荧光定量 PCR 仪，设置适宜的扩增程序（变性 95℃ 10s，退火 / 延伸 60℃ 30s，40-45 个循环），实时采集荧光信号，生成扩增曲线及溶解曲线。
三、客户需准备
1. 样本要求
- 类型：全血（需 EDTA 或柠檬酸钠抗凝，避免肝素干扰，2-8℃ 冷藏运输）、新鲜组织（建议体积 ≥50mg，液氮速冻后 -80℃ 保存）、细胞（数量 ≥1×10⁶ 个，PBS 洗涤后离心沉淀，-80℃ 保存）。
- 备注：需提供样本来源（如人、小鼠、大鼠等）及处理状态（如是否经过药物处理、培养条件等），以便优化实验方案。
2. 引物相关
- 可自备引物（需提供序列、浓度及纯度信息），或委托本实验室设计合成（需额外说明）。
3. 基因信息
- 需明确目的基因名称、物种来源，并提供基因序列（FASTA 格式）或 GenBank 登录号（Accession Number），以便精准设计引物及验证特异性。
四、交付成果
- 实验报告：包含详细的实验流程记录（如样本处理方法、试剂型号、仪器参数、引物序列等）、质控结果分析（核酸纯度检测、引物有效性验证）及实验结论，确保实验过程可追溯、可重复。
- 原始数据：提供完整的扩增曲线（荧光强度随循环数变化趋势）、溶解曲线（产物特异性验证，单峰说明扩增特异性良好）及 Ct 值数据（包含重复样本的均值、标准差），支持进一步统计分析。
- 增值服务：可根据需求提供相对定量分析（如 2^(-ΔΔCt) 法计算基因相对表达量）或绝对定量标准曲线，助力数据解读与科研应用。
五、服务列表
| 项目 | 备注 | 周期 |
| 引物设计与合成 | 3个工作日 | |
| 提取 | RNA提取、miRNA提取、DNA提取 | 2个工作日 |
| 反转录 | 2个工作日 | |
| qPCR反应 | SYBR Green方法，相对定量 | 2个工作日 |